關(guān)于細(xì)胞凍存液應(yīng)用技術(shù)的分析

細(xì)胞凍存液是細(xì)胞凍存時(shí)必須的一種溶液，長期以來大量國內(nèi)外生物細(xì)胞學(xué)術(shù)相關(guān)書籍介紹的常規(guī)凍存液配方和我們長期所使用的凍存液各組分體積百分比均為細(xì)胞培養(yǎng)液70 80%，牛血清10 30%，二甲基亞砜10%。常規(guī)使用的培養(yǎng)液如MEM、M199、 Eagle和DMEM等均已市場商品化。凍存液的作用是使細(xì)胞均勻地分散在溶液中，給細(xì)胞一個(gè)均勻分布的環(huán)境和空間，同時(shí)供給細(xì)胞生命代謝所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，防止或減少冷凍冰晶對細(xì)胞的損傷。在長期的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，廣泛使用上述配方凍存細(xì)胞。大量的實(shí)際生物細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和大量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，采用這種凍存液所凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后存活率一般在50 70%，成活率比較低。凍存細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇，培養(yǎng)12小時(shí)后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，存活率一般在60%左右；當(dāng)存活率小于50%時(shí)，細(xì)胞生長繁殖緩慢，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞比較細(xì)小，長勢比較差，基本上不能存活；當(dāng)細(xì)胞存活率在60%左右時(shí)，細(xì)胞分布比較均勻，活細(xì)胞比較多，形態(tài)比較正常，長滿單層需要6 8天。目前采用的細(xì)胞凍存液的凍存過程與復(fù)蘇效果常規(guī)細(xì)胞凍存液包括以下體積百分比的各組分細(xì)胞培養(yǎng)液70%，小牛血清20%，二甲基亞砜10%。以上各組分混勻即成。細(xì)胞凍存過程培養(yǎng)生長成單層的VER0、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17細(xì)胞一瓶，其細(xì)胞密度約6X IOVcm2、培養(yǎng)面積為225cm2，0. 25%的胰酶消化2分鐘，棄掉胰酶，加入培養(yǎng)液10ml，吹打混勻細(xì)胞懸液，離心1500轉(zhuǎn)/10分鐘，棄上清，加入常規(guī)的凍存液20ml混勻， 2ml/管分裝入潔凈的凍存管；將該凍存管置于2 8°C 2小時(shí)，-20°C 2小時(shí)，_80°C過夜， 然后浸入液氮中長期保存。細(xì)胞復(fù)蘇過程從液氮中取出凍存的VER0、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17細(xì)胞一管 (2ml/管)，置入37°C水浴溶解，離心1500轉(zhuǎn)/10分鐘，棄掉上清，加入20 %小牛血清培養(yǎng)液10ml，置37°C培養(yǎng)；培養(yǎng)12小時(shí)候后觀察，可見有60%左右的細(xì)胞貼壁；未長成單層細(xì)胞，更換10%的小牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，6 8長滿單層細(xì)胞后傳代培養(yǎng)。在生物技術(shù)飛速發(fā)展的今天，人們在生物技術(shù)學(xué)及其相關(guān)科學(xué)的研究中，越來越多的運(yùn)用組織細(xì)胞培養(yǎng)繁殖技術(shù)，將有研究意義或有應(yīng)用前景的組織細(xì)胞采用低溫度進(jìn)行長期的保存，一旦有需要，可以隨時(shí)對所的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，恢復(fù)其完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特征，供生命科學(xué)研究使用，細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的效果是直接影響細(xì)胞增殖成功與否的的關(guān)鍵技術(shù)。 

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